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real-time qpcr so easy?

【2016-05-27】


实时荧光定量pcr技术是在定性rcr技术基础上发展起来的核酸定量技术,于1996年由美国applied biosystems公司推出。是目前确定样本中dna(或cdna)拷贝数最敏感、最准确的方法。实时荧光定量pcr法最大的优点是克服了终点pcr法进入平台期或饱和期后定量的较大误差,实现dna/rna的准确定量。该技术具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点,所以该技术从产生到现在短短的二十年时间,在科研及检验领域获得了广泛的应用,成为分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。今天大阅哥就来跟您八一八实时荧光定量pcr的那些事……



实时荧光定量pcr(real-time qpcr)是在pcr反应体系中加入一种荧光化学物质,随着pcr反应的进行,pcr反应产物不断累积,荧光信号强度也随之等比例增加,每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化实时监测整个pcr进程,使每一个循环变得“可见”,通过ct值和标准曲线对样品中的dna(or cdna)的起始浓度进行准确定量的方法。……什吗?原理您都知道,好那咱们针对几个重点问题来做回答吧!


q1:实时荧光定量pcr主要应用在哪些方面?

a1:实时荧光定量pcr主要应用在以下3个方面:1.dna或rna的绝对定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物的转基因拷贝数检测。2.基因表达差异分析。例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理,物理处理,化学处理等),特定基因在不同时期的表达差异以及基因芯片差异结果的验证。3.定性分析。例如snp检测,基因分型,甲基化检测等等。


q2:实时荧光定量pcr主要用什么方法?用什么仪器?

a2:主要是taqman探针法和sybr green i法:taqman探针法特异性比较好,定量比较准确,可做多重pcr,但是探针设计难度高;sybr green i法使用方便,成本低,但是对引物的设计要求比较高,不能形成引物二聚体。

常见的仪器有abi 7500、7900ht,罗氏lc480等,阅微基因采用abi 7900ht,它是唯一的一款采用激光作为光源的荧光定量机器,灵敏度和准确性高,重复性好,且价格昂贵,是常规abi 7500的2倍,常被用于高端实验。


q3:荧光定量pcr可以检测哪些基因类型?

a3:可以检测dna,mrna,mirna,lncrna和环状rna等。microrna的实时定量pcr(real-time quantitative pcr)检测运用成熟的实时定量pcr技术准确、快速地定量检测各种组织、原代细胞及细胞系中目的microrna的表达情况,具有灵敏度高、实验周期短和特异性高等特点。阅微基因的技术人员通过4年的探索和努力,在mirna表达检测方面积累了丰富经验,探索出多种有效的实验方法。


q4:如何选择合适的内参基因呢?

a4:常见的物种做mrna试用actin做内参,mirna检测使用u6做内参,特殊物种根据文献选择合适的内参。对于一些无法确定内参的物种,我们可以提供内参基因筛选服务,选出稳定的内参用于后续实验。


q5:荧光定量pcr时需要对样品做标准曲线吗?

a5:常规验证引物扩增效率需要针对每对引物做标准曲线,相对定量的标准曲线样本采用浓度最高的模板作为标准品,绝对定量的标准品为包含待测基因的质粒dna,标准品需稀释5个不同的稀释梯度,每个稀释梯度10倍,相对定量标准品每个梯度稀释2~5倍。如果引物扩增效率达不到2,用实际的扩增效率进行修正,但不影响变化趋势,如果实验要求不高,也可以不做。


q6:我做的标准曲线,线性关系不好,原因何在?

a6:标准曲线线性关系不佳的原因可能有:1.加样存在误差使得标准品不呈梯度。2.标准品出现降解,应避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品。3.引物或探针不佳。


q7:扩增曲线中为什么会出现“无ct值出现”的情况呢?

a7:可能是检测荧光信号的步骤错误:一般sg法采用72°c延伸时采集,taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。也有可能是引物、探针或者模板降解。


q8:我的ct值是出来了,但是出现的太晚了(ct>38)是肿么回事?

a8:导致这种现象最可能的原因是扩增效率低,应该优化反应条件,设计更好的引物或探针;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等。也有可能是pcr反应各成分不足,或者pcr产物太长,根据阅微基因的经验,一般建议采用80-150bp的产物长度。


q9:ct值看着没问题,可是为什么熔解曲线不只一个峰呢?

a9:可能是引物设计不够优化,先提高退火温度,适当降低镁离子浓度和引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。优化后还是有非特异的峰,需要重新设计特异性引物扩增。


是不是觉得实时荧光定量pcr没那么简单了呢~阅微基因从事荧光定量服务多年,有丰富的实验经验,通量高,且可以检测低丰度的rna样本,比如血浆样本、石蜡切片;另外,阅微基因还可以为您提供microrna表达检测,lncrna、环状rna的验证等,还等什么,快call我们吧!

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