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专家采访

关于细胞鉴定的那些事

【2016-09-25】

细胞系str鉴定发展历程

一个细胞系,从分离组织到获得一种新的细胞系开始,就应该具有其起源等的详细资料,随着细胞系成为科学研究中重要的工具,所使用的细胞系的真实性、是否发生交叉污染等问题变得越来越重要。显然,科学家们开始并未意识到这个问题的严峻性,以下是细胞系str鉴定的发展历程,直到今天,还有许多错误鉴定和交叉污染的细胞株,甚至科学家们使用了不正确的细胞系,严重影响了实验结果的真实性。

 


2001年 pnas发文short tandem repeat (str)profiling provides an international reference standard for human cell lines指出str分型技术为人类细胞系的鉴定提供了国际参考标准。

2007 年一份生物储存库材料审核结果表明,三分之一或更多的细胞系被错误鉴定或受到污染;nih发布了通知,强烈建议在使用培养细胞的时候进行鉴定(authentication)2008 年底,专家提议atcc致力于人源细胞系的鉴定工作,并制定鉴定的标准程序。

2009年 nature发文identity crisis:it is time for all involved to tackle the chronic scandal of cell-line contamination。

2010年 nat rev cancer ——cell line misidentification:the beginning of the end。

2011年美国菌种保藏中心(atcc)制定了人源细胞系str鉴定标准ansi authentication of human cell lines:standardization of str profiling。

2012年nature发文cell-line authentication:end the scandal of false cell lines说明了细胞系鉴定的重要性。

2013年nature旗下杂志要求作者需注明研究中细胞系的来源,避免科学研究因为细胞系有误得出不正确的结果。

2014年12月、2015年2月science杂志分别发表专题文章,阐述细胞交叉污染和错误辨识的严重性。

2015年4月,nature旗下所有杂志将要求作者鉴定论文中所用细胞系。

2015年6月即有报道称一科学家因细胞系污染,被nature撤销发表于其上的论文。

2016年4月中国科学院昆明细胞库公布共60株错误鉴定和交叉污染的细胞系。

 

阅微基因——您身边的细胞str鉴定专家 

更早

阅微基因是更早开展细胞str鉴定服务的公司,在领域内享有盛名,积累了10多年的细胞鉴定及亲子鉴定资质和资历,具有很强的竞争力。

更全

同时检测分析12、21个str基因座,可以鉴定包括人源、鼠源、猴源等细胞及其交叉污染;

微量样本0.1ngdna(约15个二倍体基因组)即可判断细胞类型及早期的细胞交叉污染;

建立了拥有上万条人源细胞系str数据的数据库,囊括了atcc、dsmz、jcrb等细胞库人源细胞的str数据。

更权威

阅微基因作为atcc委员会成员,长期与药监局下属的检定院合作,自主研发了细胞系str鉴定体系;

国内6个大的细胞库,有4个长期与我们有长期合作的关系,另外,与国内知名疫苗生产厂商、干细胞药物研究企业及科研单位建立了长期的合作关系;

出具的中/英文报告可被各大国内外杂志期刊认可,每年可协助发表论文300篇左右;

国内原创开发了小鼠的鉴定体系,并申请了专利;目前正在开发其他物种的鉴定体系。

更专业

采用abi3500,3730xl遗传分析仪和最新的genemapper v5.0数据处理软件,自动化分析系统可大量检测及数据分析,结果更准确、客观;出具专业的中英文鉴定报告(含str分型图谱及搜库鉴定结果)。

 

 

细胞str鉴定的重要性

您是否有这样的经历……在科研工作结束之际,被你所投稿的杂志要求提供细胞str鉴定报告,而此时你研究中使用的细胞是否被污染,将决定你几个月甚至长达几年科研工作的成败。
您又是否有过这样的经历……新买到的细胞,实验室传了几代的细胞,又或者储存于超低温冰箱几年不用的细胞,被污染了么?鉴定正确么?用它做研究会影响实验结果么?

 

没有经过相应的细胞鉴定,使用了被污染的细胞,经过大量的实验,写出一篇论文,但是结论被否定,论文被召回,大量的时间、物力和人力被浪费,一切都要从头再来。

如果你是等待毕业的学生,等待你的将是延期毕业。药物、疫苗和其他生物药物都是以实验室的研究发现为基础而产生的,往往都是跟细胞培养相关。基于误导性的或虚假的数据而制造的药物产品将会导致该药品投产的延迟,同时还推迟了针对多种疾病的有效治疗手段的推出。


所以细胞str鉴定越来越重要

1  据统计约30%细胞系被交叉污染或错误辨识,因使用了交叉污染或错误辨识的细胞而导致研究结论错误、结果不可重复、临床细胞治疗灾难性后果,这浪费大量时间、精力和金钱。另有文献报道称:中国建立的人源细胞系竟高达85.51%是错的。因此近年nih、atcc、nature和science等多次发出呼吁,要求研究者对细胞进行鉴定,nih等权威机构也将细胞系鉴定作为基金申请的前提条件。str基因分型已被作为金标准应用于细胞鉴定,越来越多杂志开始要求投稿人提供细胞str鉴定结果。

目前要求提供细胞鉴定数据的期刊有:

nature

nature cell biology

nature methods

aacr journals

cancer research

clinical cancer research

cancer epidemiology, biomarkers & prevention,cebp

cancer prevention research

molecular cancer research

molecular cancer therapeutics

cancer reviews online

prevention portal

cancer discovery

cancer immunology research

international journal of cancer

journal of clinical endocrinology & metabolism

journal of endocrinology

journal of molecular

journal of molecular biology

journal of the national cancer institute

biotechniques

carcinogenesis

cell biochemistry and biophysics

cell biology international

clinical orthopaedics and related research

endocrine reviews

endocrine-related cancer

endocrinology

in vitro cellular & developmental biology – animal

molecular endocrinology

molecular vision

neuro-oncology

plos one……


2  atcc和 fda要求对用于制药领域的实验中所使用的材料 — 诸如细胞系 — 应该进行“身份鉴定”和纯度测试。 此外,fda建议研究人员在培养细胞的较早阶段(细胞培养第一周)鉴定细胞系的身份。细胞在被冻存前应再一次进行鉴定;对于活跃生长的细胞,应每两个月鉴定一次;文献发表前也应对细胞系身份进行鉴定。如果一个实验室使用不止一种细胞系,则应在实验最开始时,就要对所有的细胞系进行鉴定,以便排除交叉污染的可能。 


3  2015新版药典中,规定新建细胞系/株、细胞库(mcb、wcb)和生产的终末细胞均应进行鉴别试验,以确认为本细胞,且无其他细胞的交叉污染。(——《生物制品生产检定用动物细胞基质制备及鉴定规程》)

 

阅微基因——您身边的细胞str鉴定专家

 

服务项目:

● 人源细胞(干细胞)str分型检测

目前基因座最多的检测服务,所选用的基因座不仅包含atcc、dsmz和jcrb细胞库中的基因座,更添加11个高度多态性位点,可方便与权威数据库进行比对,具有极高的准确性。位点如下:

 

● 人源细胞来源一致性检测

● 小鼠细胞str分型检测

利用阅微基因专利产品对小鼠基因组中8个高度多态性位点:d1mit159.1、d2mit395.1、d4mit170.1、d7mit40、d11mit4、d15mit16、d17mit51.1和jarid1,进行分析

● 人/鼠细胞交叉污染检测

国内首创技术,采用人鼠复合扩增体系检测人类细胞中的小鼠细胞污染,主要应用在干细胞研究领域。同时可以用于判断人鼠细胞混淆的情况

● 猴源细胞str分型检测

● 支原体检测

 

 

何时需要进行细胞系鉴定?

● 发表相关文章或申请课题经费

● 应用细胞系作为生物医药研究的实验材料

● 使用细胞进行临床治疗(试验)前

● 准备冻存保种或已冻存多年的细胞

● 涉及到细胞试验项目开始/结束时

● 新得到的细胞或实验室传5代以上的细胞

● 细胞系表现不稳定或结果与预期差别较大

● 异体细胞移植后嵌合情况检查

 

细胞str鉴定技术原理

由于str技术具有灵敏度高(最低可检出0.1ng dna)、自动化程度高、准确快速、重复性好等优点, str基因分型已被作为金标准应用于细胞鉴定

str(short tandem repeat,短串联重复序列)基因位点由长度为3~7个碱基对的短串连重复序列组成,这些重复序列广泛存在于人类基因组中,可作为高度多态性标记,被称为细胞的dna指纹。str已被广泛应用于亲子鉴定、个体识别、司法鉴定、交通事故鉴定、(造血干细胞)移植治疗后嵌合情况监测等领域。str基因座位上的等位基因可通过pcr(聚合酶链式反应)扩增区域内重复序列的拷贝数的不同来区分,在毛细管电泳分离之后可通过荧光检测来识别,随后通过一定的计算方法,即可根据所得的str分型结果与专业的细胞str数据库比对从而推算出样品所属的细胞系或可能的交叉污染的细胞系名称。

 

阅微基因——您身边的细胞str鉴定专家

服务流程:

收集细胞——发送样品阅微——提取dna——多色荧光体系复合扩增——dna片段分离和荧光信号检测——str基因分型——数据库比对和结果分析——出具鉴定结果报告
送样要求:

细胞悬液(细胞数≥106 个)或细胞沉淀,冷冻运输;或基因组dna(≥20μl,浓度≥50ng/μl)

细胞沉淀获取方法

用pbs将细胞洗2遍后,收集细胞于一干净无菌离心管中,离心、去上清,即得细胞沉淀(细胞数≥106个,细胞沉淀应至少肉眼明显可见),用封口膜封好离心管管口以防止样品泄漏及其他细胞污染。样品随冰袋寄送至阅微即可。

 

细胞str鉴定常见问题

q:何种情况下需要进行细胞分型检测?

a:细胞交叉污染,国外的一些机构推荐对各种细胞系(新建株或外部接收)进行定期的鉴定确认;细胞情况未知或错误鉴定;干细胞研究过程中;另外很多杂志尤其是国外杂志要求投稿者必须先做细胞鉴定。


q:做细胞str鉴定有何用?

a:细胞str鉴定主要应用于人源细胞的研究与生产中,包括但不限于以下领域:医学、遗传学、药物开发、疫苗研制、生物技术和制药行业、再生医学、干细胞、肿瘤、免疫细胞治疗、病毒检测和治疗及基础细胞生物学等,通过细胞str鉴定,您可以:1. 判断培养的细胞是否被其他细胞交叉污染及其可能被污染的细胞名称;2. 明确知道自己正在使用的细胞是否“正确”——2015年有文献报道称:国内建立的人源细胞系错误率竟高达85.51%!


q:有些细胞系是自己实验室发现的,在atcc等细胞库中没有入库,能否做细胞鉴定?

a:能,虽然在数据库中没有其str数据,但我们仍建议您进行细胞str鉴定,因为我们的试剂盒是针对基因的多态性位点进行扩增,无论是哪个种属的细胞均能得到扩增,另外通过该项检测,您可以:1. 判断培养的细胞是否被其他细胞交叉污染及其可能被污染的细胞名称;2. 您将是第一个得到该细胞系str数据(dna指纹)的人;3. 申请将该细胞系的str数据保存于权威的数据库中。


q:可以对哪些物种进行细胞鉴定?

a:人源的细胞系(包括人干细胞)和小鼠的细胞系在实验室中最为常见,我们主要针对这两种细胞进行鉴定;另外,还可以鉴定人源细胞中的鼠源细胞污染,鉴定猴源的细胞;目前正在开发猪、狗的细胞鉴定体系。


q:阅微基因做的鉴定结果在投稿时是否被认可?

a:是。阅微基因是atcc标准委员会委员,而且阅微基因做的细胞鉴定结果已用于发表文章。


q:在做细胞ssr检测时为什么选择的位点有些并未出现在atcc、jcrb、dsmz等数据库中?

a:目前这些数据库中发布的都是9位点比对,且这9个位点相同。为了更好的进行细胞分型,鉴定是否被污染,阅微基因除选择标准的9个位点以外,还设计鉴定其他位点,追求更高的准确性。


q:请问阅微基因的项目周期为多长?

a:1~48个样品,在确认收到样品及相应款项后2~5个工作日内完成鉴定工作;49~96个样品,在收到样品及相应款项后3~7个工作日内完成鉴定工作。


q:阅微基因给客户提供哪些资料?

a:单个细胞系的分型图谱及中英文书面报告,包括与细胞库的比对结果。


阅微基因——您身边的细胞str鉴定专家

 

发表文章

1. wei ji at all. expulsion of micronuclei containing amplified genes contributes to a decrease in double minute chromosomes from malignant tumor cells.

2. stefano giustinomanzo at all. natural product triptolide mediates cancer cell death by triggering cdk7-dependent degradation of rna polymerase ii. cancer res; 72(20); 5363–73. applied entomology and zoology august 2013, volume 48, issue 3, pp 409-412.

3.  ke-wu zeng, ning li, xin dong, zhi-zhong ma, yong jiang, hong-wei jin, peng-fei tu. sprengerinin c exerts anti-tumorigenic effects in hepatocellular carcinoma via inhibition of proliferation and angiogenesis and induction of apoptosis. european journal of pharmacology volume 714, issues 1–3, 15 august 2013, pages 261–273.

4. luo, cheng at all. hydroxytyrosol promotes superoxide production and defects in autophagy leading to anti-proliferation and apoptosis on human prostate cancer cells. current cancer drug targets, volume 13, number 6, july 2013 , pp. 625-639(15).

5. fei liu, wei jiao, xiang lan mo, jiao lan, rui ping xiao, xiang zhen zhou, zhen lu huang, xiao min mo, gang li. molecular pathological study of the human nasopharyngeal carcinoma cne3 cell line. oncology letters, volume 6, number 4, october 2013, pages 980-984.

6. fu w., du z.-x., ren h., buahom n., liu h.-w. and huang x. 2013 polymorphic microsatellite markers in taxuschinensis var. mairei(taxaceae). j. genet. 92, e81–e84.

7. zhao wua at all. derivation and characterization of human embryonic stem cell lines from the chinese population.journal of genetics and genomics volume 38, issue 1, january 2011, pages 13–20.

8. fang ye at all. genetic profiling reveals an alarming rate of cross-contamination among human cell lines used in china. the faseb journal article fj.14-266718. published online june 26, 2015.

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