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专家采访

snp(单核苷酸多态性)准确性的验证,你造吗?

【2016-12-12】

snp(全称single nucleotide polymorphisms)即单核苷酸多态性,主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的dna序列多态性,包括单个碱基的转换、颠换等。snp定位分类:可分为基因编码区、基因周边以及基因间snp等三类;snp位置区域包括utr区、编码区的外显子或内含子区 、可变剪切位点等等。

snp是人类可遗传变异中最常见的一种,占所有已知多态性的90%以上,所以snp的应用范围较微卫星标记更加广泛,在群体遗传学、生态环境学、制药业、法医学、癌症及遗传性疾病甚至进化方面的研究都有不同程度的应用。研究人员希望通过snp的研究,更深刻地认识癌症、糖尿病、血管性疾病和某些精神性疾病等多基因疾病的发生机制,主要应用有:

1、确定基因多态性和疾病的关系   

2、解释个体间的表型差异对疾病的易感程度 

3、对未来疾病做出诊断 

4、研究不同基因型个体对药物反应的差异,指导药物开发及临床合理用药 

5、个体间snp千差万别,通过snp检测等技术进行法医鉴定及个体识别


snp的研究前期通常基于下一代测序(ngs)技术对大量样本进行全基因组测序,通过与参考序列的比对发现并构建snp数据库,之后对数据库中大量的snp进行验证,并经过统计学分析找到少量与疾病或性状关联的snps。目前对snp进行验证检测的方法主要有:


1、 扩增测序

    原理:sanger测序

    特点:方法稳定,可靠,通量低,成本高



2、snapshot 检测

    原理:基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术,也称小测序。在体系中加入测序酶,四种荧光标记的ddntp,紧挨多态位点5,端的延伸引物和pcr产物模板,pcr扩增过程中,引物延伸一个碱基即终止,经abi测序仪电泳后,根据峰的颜色可知掺入的碱基种类,从而确定该样本的基因型,根据峰移动的位置确定该延伸产物对应的snp位点。


    特点:

a)采用多重单碱基检测技术,每次可以检测10~20个位点,通量高,速度快;

b)同时检测基因组任何位置上的snp位点,且数据完整性高;

c)基于3730xl测序仪平台的检测技术,直接得到位点的碱基组成,检测结果直观、稳定、可靠;

d)价格比较低廉。


3、mass array

    原理:该技术基于sequenom质谱仪平台,通过pcr扩增出含有snp位点的一段dna(snp位点前后各50bp左右),用sap酶去除掉pcr 体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dntp),加入一单碱基延伸引物,其3’末端碱基紧挨snp位点,采用四种ddntp替代dntp,这样,探针在snp位点处仅延伸一个碱基,连接上的ddntp与snp位点的等位基因对应,树脂交换,纯化延伸后产物,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof ms)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异,确定该点处碱基。


    特点:

a) 一次可以检测20-40个位点;通量高,一次可以检测384个样本;

b) 1管式操作,避免换管,降低被污染的概率;

c)检测灵敏,可检测pmol级别的物质;

d)适合大量样本检测,但是有一些snp位点不适合设计延伸引物,无法检测,且缺失的数据难以补充。



4、taqman探针法

    原理:该技术基于实时荧光定量平台,每个snp位点设计一对taqman探针,分别标记不同的荧光。5’末端携有报告荧光基团,3’端标有荧光淬灭基团,taq聚合酶具有外切活性,从而将探针5 ’端连接的荧光分子从探针上切割下来,破坏两荧光分子间的pret,发出荧光。


    特点:
a)操作简单、检测速度快、灵敏度高;
b)一次一般检测1个位点,两个snp位点之间太近或者snp序列附近有特殊结构,不易设计探针;
c)少量样本检测费用高,适合位点少,样本量大的情况。



除了上述几种方法,还有焦磷酸测序、hrm(高分辨率溶解曲线分析技术)、microarray芯片法、maldi-tof、dhplc(变性高效液相色谱技术)、rflp、sscp、dgge等。


阅微基因在snp检测方面有丰富的经验,开展多种不同的检测方法,可根据客户的样本和位点的数量选择合适的实验方法。每个项目的检出率不低于95%。针对有特殊结果的位点,我们会采用便捷的dna聚合酶,确保每个位点都有实验结果,进一步确保了客户数据的完整性。另外,阅微基因可以针对口腔拭子,唾液等样本提取dna进行snp检测分析。在此基础上提供基因分型分析、关联分析、聚类分析、遗传图谱等服务,使客户的研究更顺利。

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