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real time qpcr 您身边的基因转录实时监控专家

【2017-10-19】

基因作为生物体最为重要的信息载体,储存着生物体全部的遗传信息,决定着生物的性状、分类、生命周期等各种特征,然而基因往往不直接参与生命活动的调控。对于高等生物,在满足「中心法则」原则的情况下,基因(dna)通过转录形成 rna,一些 rna 通过特定的方式翻译形成蛋白质,而蛋白质才是直接参与生物性状决定的最主要物质。rna 作为联系基因和蛋白的重要桥梁,在基因信息的翻译以及调控基因转录、核酸剪切等多方面的具有重要作用,这也使得对于 rna 的研究和检测显得尤为重要。

 

rna 检测其实对于我们每个人都不陌生,前段时间令人闻风丧胆的禽流感病毒和乙型肝炎病毒复制度的检测。天然状态的 rna 常为单链,结构不稳定,容易被 rna 酶降解,需要在逆转录酶的作用下转化形成更为稳定的 cdna,以方便检测。目前 cdna 定量检测方式主要以 real time qpcr 染料法和 real time qpcr 探针法为主。 

real time qpcr 染料法 (如图 1 所示) 采用一种能与 dna 特殊结合的荧光染料 sybr greensybr green 属于一种结构扁平的化学小分子,具有微弱的荧光,能够特异性与 dna 的小沟结合并发出强烈荧光,荧光的强度与体系中 dna 的含量成正比。染料法具有操作简单、价格便宜等诸多优点,但是也存在由于荧光染料能与所有的 dna 结合而引起的特异性不强、只能相对于内参进行相对定量等缺点,这也决定了染料法通常仅限于实验室使用,而在医学诊断中使用有限。

real time qpcr 探针法(如图 2 所示)需要人工合成带有发光基团 r 和淬灭基团 p(常采用 mgb 修饰)的单链 dna 探针以及一对特异性的 pcr 引物。单链 dna 探针需特异性的识别和结合 cdna 预扩增区域。当发光基团和淬灭基团与 dna 探针结合完好时,反应体系将不具有荧光,而在 pcr 的过程中,由于 taq 酶具有 5′-3′外切酶活性 (此活性是双链特异性的,游离的单链探针不受影响),将会使与 cdna 结合的探针 5′端的发光基团游离出来而发出荧光,荧光的强度与复制的次数成正比。探针法虽然存在操作较复杂、价格偏高、探针设计和标记复杂等方面的不足之处,但是具有特异性强,测值稳定,能够完全定量等一系列的特点,使得探针法能在医学诊断中被广泛使用。

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